制備型超高速離心機的幾種分離方法：

A.差速離心：逐次增加離心力，每次可沉降樣品溶液中的一些組份。

差速離心是一種常用的方法。在這種方法中，離心管在開始時裝滿了均一的樣品溶液。通過在一定速度下一定時間的離心后，就可得到兩個部份：沉淀和上清液。

通常在第*次離心時把大部分不需要的大粒子沉降去掉。這時所需的組份大部分仍留在上清液中。然后將收集到的上清液以更高速度離心，把所需的粒子沉積下來。離心的時間要選擇得當(dāng)，使大部份不需要的更小的粒子仍留在上清液中。對于得到的沉淀和上清液可以進(jìn)行進(jìn)一步的離心，直到達(dá)到所需要的分離純度為止。

差速離心的特點是操作簡單，但分離純度不高。

B.密度梯度離心法：可以同時使樣品中幾個或全部組份分離，具有很好的分辨率。

1)速率區(qū)帶法(rate zonal)：

根據(jù)樣品中不同粒子所具有的不同的尺寸大小及沉降速度(S)。大致步驟如下：

在離心管中裝入密度梯度溶液，溶液的密度從離心管頂部至底部逐漸增加(正梯度)。

將所需分離的樣品小心地加至密度梯度溶液的頂部。樣品在梯度溶液表面形成一負(fù)梯度。

由于不同大小的粒子在離心力作用下，在梯度中移動的速度不一樣，所以經(jīng)過離心后會形成幾條分開的樣品區(qū)帶。

注意：樣品粒子的密度必須大于梯度液注中任一點的密度。離心過程必須在區(qū)帶到達(dá)管子底部前停止。

2)等密度離心法(isopycnic)：

根據(jù)粒子的不同密度來分離。離心過程中，粒子會移至與它本身密度相同的地方形成區(qū)帶。

密度樣度的選擇要使梯度的范圍包括所有待分離粒子的密度。樣品可以在密度梯度液粒上面或均勻分布在密度梯度中。經(jīng)離心后，樣品粒子達(dá)到它們的平衡點。注意：平衡后粒子的分離*由其密度決定，與時間無關(guān)，此時再改變離心轉(zhuǎn)速，只能改變區(qū)帶的相對位置。 2.密度梯度分析法

1)梯度介質(zhì)性質(zhì)與選擇：

A、應(yīng)具備的性質(zhì) ：

梯度物質(zhì)的選擇原則是滿足分離方法的基本要求，一個理想的密度材料標(biāo)準(zhǔn)它應(yīng)是：

· 所形成的溶液密度應(yīng)包括所需要的密度范圍。

· 具有某些性質(zhì)，如折射率，據(jù)此可測定它的濃度。

· 所形成的溶液粘度低。

· 不損傷所分離的樣品。

· 離心分離后容易除去。

· 不妨礙分離積分的分析。

B、常用介質(zhì)種類：

表一、常用梯度材料在20℃密度

B.梯度介質(zhì)應(yīng)用范圍：

表二、等密度梯度介質(zhì)的應(yīng)用

+++很好 ++好 +可以 --不適用

表三、各種大分子在蔗糖梯度液中的大約密度

2、梯度溶液的準(zhǔn)備：

計算

稀釋(本文第三章第*部分)

(3)、梯度形狀

梯度形狀分：線型、等速型、階梯型、平坦型、陡峭型指數(shù)梯度。(如下圖)

梯度形狀對于分離是否成功非常重要：

常用的是線型梯度，適用于分離蛋白質(zhì)、酶、激素、核糖體亞基和一些植物病毒;等速型適用于分離脂蛋白和一些需上浮分離樣品;不連續(xù)或階梯型梯度適用于分離整細(xì)胞、亞細(xì)胞組分以及純化一些哺乳類動物病毒或昆蟲病毒。等速梯度以及長液柱可增進(jìn)分離能力，適用于分離核糖體亞基、多核糖體及植物病毒。

B.梯度柱制備：

梯度液柱可以用手工或梯度儀制備

半注法：

為縮減離心時間，或分離樣品較少可用半注法：下半管鋪置梯度介質(zhì)，中間加樣品，上面鋪Buffer或液體石臘油。

(4)、加樣方法與加樣量：

將樣品加到梯度液柱上，針尖和離心管成45-60°角度，慢慢地將樣品沿管壁流到液面上去，對于DNA一類易斷的脆弱樣品，應(yīng)該用孔徑較大的移液管代替針頭，以避免剪切力對樣品的切割作用。樣品濃度是梯度柱小密度的1/10(W/W)。

(5)、轉(zhuǎn)子的選擇與效應(yīng)：

(6)、分離區(qū)帶的回收及檢測

離心后所形成的區(qū)帶樣品的回收方法基本有四種：

a.穿刺法

穿刺離心管底部，使梯度溶液滴出，將一具有合適閥門的蓋帽放在離心管頂，可控制滴出速度。

b.虹吸法：

將一毛細(xì)管輕輕插入管底，盡量防止梯度抖動，用微量泵逐漸滴取，以一定量滴數(shù)或體積部分收取。

c.加壓法：

通過一針管將高密度的液體泵入到梯度離心管的底部，部分收集換出的溶液。

d.切割法：

采用的切割刀切割所需區(qū)帶。

區(qū)帶檢測：

所謂區(qū)帶檢測，實際上是對水平轉(zhuǎn)子或角轉(zhuǎn)子和垂直轉(zhuǎn)子離心管中的分離物質(zhì)所做的監(jiān)測，通常只是測量在260或280mm時長的吸收值，以決定梯度中的核酸或蛋白的整個分布，這個操作通常稱之為在線(on line)監(jiān)測。